水試所電子報第108期
 
核酸定序的下一個里程碑:次世代定序
 
 
  自2003年人類基因體完成定序後,分子生物學正式邁向後基因體時代(Post-Genome Era),許多新興學門亦應運而生,如代謝體學、蛋白質體學、藥理基因體學、毒理基因體學等,這些學門有一共同的特性,就是必須仰賴更快、更經濟、資料量更大的核酸定序,也因此開啟了次世代核酸定序的新頁。   

  現階段核酸定序(DNA Sequencing)的方法有兩種,分別為英國學者Frederick Sanger發表的一代定序(又稱為Sanger定序)及德國生技大廠羅氏(Roche)公司開發的次世代定序(Next Generation Sequencing, NGS)。一代定序係利用聚合酶鏈鎖反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)、去氧核苷酸(dNTPs:dGTP、dATP、dTTP、dCTP)以及雙去氧核苷酸(ddNTPs:ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTP),將DNA聚合時隨機終止的譯碼重新組合後,進行核酸定序,自1977年發表以來,至今仍是最常用的DNA定序方法,亦為人類基因組計劃所使用主要定序方法。但是如何在不過度提高成本及花費時間的前提下提高定序效率?成為科學界思考的目標,隨著第一片生物晶片(Microarray)問世,生物技術走向了基因高通量分析(High-Throughput Analysis)的時代;直到西元2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System,正式寫下次世代定序的序章。

  次世代定序又稱為大量平行定序(Massively Parallel Sequencing, MPS),是建構在一代定序的基礎上開發出的新技術,藉由同時間大量的短序列片段(Short Reads)定序達成高速以及高通量的效果,且樣品不需經質體複製就能進行定序,減少了複製過程可能出現的錯誤率。

  現階段常見的次世代定序技術為ABI開發的SOLiD、Helicos開發的tSMS、roche開發的454以及Illumina開發的Solexa,次世代定序每次反應產出的序列數據量約為一代定序的十萬倍(表一);以Solexa為例,其運作原理為將待測核酸樣品分解成200~500bp不等的短片段並接上Adapter,將其放入帶有adapter互補序列之晶片上(圖二)再透過橋式聚合酶鏈鎖反應(Bridge PCR)進行擴增,使片段在晶片上產生叢集(Cluster)(圖三),隨後以Polony Sequencing以及Reversible Terminator Chemistry的原理加入帶有可移除之螢光分子的dNTP,反覆進行螢光標記的移除與偵測,達到大量定序的效果。

  本所目前利用NGS技術進行的研究包括:龍膽石斑及白條海葵轉錄體學研究、經濟性珊瑚礁魚類族群遺傳結構研究以及於消化道細菌組成分析,運用此技術將可大幅縮短研究時程與經費,並獲得更大量的數據資料;以消化道細菌組成分析為例,相同的研究經費利用NGS技術比起現行常規程序所得的DNA定序結果多達10000倍以上。

  次世代定序的成熟以及普及化,使得針對生物體內系統性變化的觀測不再遙不可及,如當生物體受到病原入侵後,可以藉由次世代定序結果研究生物體免疫系統的作用機制甚至是未知病原感染的關鍵變化,相較於現今核酸定序的單一基因分析,快速且廣域的定序方式宣示了生物技術將不再侷限於單一物種或是單一基因的研究方式,而是走向更寬廣且全面化的系統性生物學分析。

 表一、兩種定序方式之樣品需求及產出比較
表一、兩種定序方式之樣品需求及產出比較

圖二、待測核酸序列與Adapter之接合反應,合成序列與晶片上互補Adapter結合

圖三、橋式聚合酶鏈鎖反應 (Bridge PCR) 以及叢集 (Cluster) 的產生,隨後將藉由螢光訊號進行叢集分群

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