水試所電子報第123期
 
利用一桶水辨識水中棲息的魚種
 
 
  本所於5月19日邀請日本千葉縣立中央博物館的主席研究員宮 正樹博士蒞臨本所演講,介紹其最新發表的「利用萬用引子MiFish進行環境DNA中魚類的複合條碼定序:以數據資料分析魚類群聚」(Environmental DNA metabarcoding of fishes using universal PCR primers MiFish: A data-driven approach for fish community),能利用一桶水,便可探測出棲息於該水域的魚類種類。以前要調查海中、湖沼或河川裡的魚類多樣性時,必須使用網具、釣具、甚至潛水調查等方式,需要耗費許多人力、物力以及時間,並且魚類的種類鑑定需要高度專業的知識與經驗才能勝任。而該技術的開發,將生物的DNA鑑定與生物資訊分析結合,宣告了魚類多樣性調查Big data解析時代之到來。

  有關生物種類的鑑定,拜DNA序列分析研究的進展,我們已能利用同一個DNA片段來辨別出不同的生物種類,並進一步發展成DNA barcode的概念,即將DNA訊息視同如商品的條碼barcode,把所有魚類都用同一段DNA定序、建立檔案,將傳統形態分類需仰賴不同魚種的形態特徵差異比較,轉化為DNA上的A、T、C、G鹼基對的排列順序比對,使物種鑑定的流程得以標準化,我們便能依其DNA barcode將該魚的正確種類鑑定出來。

  近年開始出現環境DNAenvironmental DNA, eDNA)的概念,即水中生物如魚身上的DNA可能藉由魚體表的黏液或糞便等排出物而進入水中,於是DNA取得便可跳過生物採集的步驟,而直接從水體中收集。由於環境中的eDNA來源很複雜,可能來自各種不同的水中生物,並且常會碎裂成較小片段,因此所選用的DNA marker片段不能太長,研究中所選用的DNA片段長度大約為200bp,而這個短短的片段又要包含有足夠的訊息,將世界上所有的魚類給分辨出來。另一方面,用來增幅DNA所需的共同引子,還得要儘可能地與不同的魚類相結合。也由於引子設計的困難度很高,之前的eDNA研究大多針對單一物種,如某種稀有的兩棲類、魚類或外來種等,偵測其是否存在該水域。而宮 正樹博士想一舉解決這些marker的需求,不但要長度短、要兼顧多樣性,也要能異中求同。在經由大量魚類序列比對中,終於從880種魚類的DNA中成功篩選出一段長度約163-185bp的粒線體12S rRNA部份基因片段,能完全符合上述目標,並將該引子命名為「MiFish」。

  第二個困難點則是水體中的eDNA已被稀釋,訊號很微量。宮正樹博士在增幅DNA時使用two-step tailed PCR的方法來克服,即設計兩組帶有尾巴的引子,第二組primer可以搭上第一組primer的尾巴,進行第二次增幅,將訊號再作一次放大。而上述中利用一組universal primer同時進行多種生物DNA barcoding的技術,便稱之為「metabarcoding」。

  傳統的DNA定序方法,一次只能處理一個物種的一個DNA片段,若同時包含兩個以上物種或DNA片段,則需要再透過細菌培養,將各個DNA片段分開後分別選取定序,否則片段間的訊號會互相干擾成雜訊,影響序列判讀。近10年發展的次世代定序技術(Next Generation Sequencing, NGS)提供了宮正樹博士解決方案,其能同時處理大量核酸片段,進行高通量定序,並利用電腦協助序列分析。以此研究來說,其可同時定序並讀取高達4萬多筆DNA序列,於一片DNA序列汪洋中,再利用程式(Analysis Pipeline)於MitoFish資料庫中比對其所屬魚種,並計算出屬於該魚種的DNA條數。研究所用的資料量非常龐大,需要仰賴生物資訊學門與電腦演算的配合。

  再來就是水樣的採集,該研究使用孔徑0.7 µm的玻璃纖維濾膜,過濾約10 L的水樣,將水中的eDNA過濾出來,以進行後續的metabarcoding實驗。宮 正樹博士說明其eDNA的取得範圍,經測試過可達數百公尺,即在此範圍內出現的魚,其DNA便有可能被收集到。

  完成MiFish引子的設計與metabarcoding技術的開發後,接著選擇在沖繩的「美麗海」水族館測試威力。宮 正樹博士說選擇「美麗海」水族館的第一個好處是其有不同水域的缸體,包括黑潮大洋缸、紅樹林缸、熱帶魚缸、深海缸等,涵括物種廣泛,其次為水族館內的魚種可以確定其名錄,得以比對DNA的鑑定率,第三便是沖繩是個美麗的地方。宮 正樹博士在開場白便闡述他的研究哲學是要做自己開心的事,其在研究之餘的樂趣是下廚做菜。他說:在沖繩做研究便是一件讓人開心的事。

  而實驗的結果很令人振奮,其鑑定率達到93.9%,甚至連過往研究中無法處理的軟骨魚類都能正確鑑定。另分析部份有問題的序列後,發現其對於鮪魚的鑑定無法正確對應種類,故再利用粒線體的ND5(180 bp)設計了專門針對鮪魚的primer,於是不管是黃鰭鮪、長鰭鮪、大目鮪或不同大洋的黑鮪等也都獲得解決。實驗最後的測試結果,已能正確分辨出館內的232種魚類,涵蓋70科152屬。

  MiFish的研究成果,對於大空間、長時間尺度的生態調查或是生物多樣性的監測等帶來跨世紀般的進展,能節省大量調查時間與人力的投入。宮 正樹博士說他出差採水一次就可完成沖繩的魚類調查,而這在過去則要耗費2年以上及多位專家的採集與潛水觀測才能得到完整資料。DNA barcoding的鑑定技術仍需建立在已完成其傳統分類研究,並取得該種DNA序列的基礎上。目前全世界已知有27977種魚類,而MiFish的資料庫中已涵括了4230種魚類的DNA。隨著參考比對的序列資料庫(reference database)越完備,MiFish的應用範圍也將更廣。例如可協助未知魚種的發現,在難以抵達的深海進行魚類調查,或是已知魚種(比如說腔棘魚)在未知棲息水域的檢出等。

宮正樹博士蒞臨本所進行專題演講陳君如所長代表本所致贈紀念牌

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