羅氏沼蝦 (Macrobrachium rosenbergii) 為熱帶和亞熱帶地區受歡迎的經濟水產養殖蝦種之一，全球年產量達290,708公噸 (FAO, 2021)。然而，近年來許多蝦類新興疾病造成養殖漁民經濟損失慘重，其中包括2010年在中國造成羅氏沼蝦提早性成熟而抑制生長的傳染性早熟病毒疾病 (infectious precocity virus disease, IPVD) (Dong et al., 2021)。IPVD 是由傳染性早熟病毒 (IPV) 引起，其為一種單股正鏈RNA病毒，呈球形，直徑40-60 nm，屬於黃病毒科 (Flaviviridae)，其基因組有 12,630 個核苷酸 (nt) (Dong et al., 2021)。羅氏沼蝦罹患IPVD的特徵是性早熟且成長緩慢，病蝦體型比正常蝦隻瘦小，公蝦前螯較為細長且呈現藍色，母蝦卵巢則會提早發育，雖不會造成蝦子死亡，但會因成長受到抑制導致產量減少。針對此疾病，Zhao等 (2023) 利用已知的IPV cDNA序列，以Primer Premier 5.0軟體，建立了巢式反轉錄聚合酶連鎖反應 (RT-PCR) 和TaqMan探針即時定量 PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR) 檢測技術。
巢式RT-PCR分析的流程分為二個步驟，並使用107–100 copies/μl不同濃度的IPV陽性標準品為模板進行靈敏度和重複性分析。第一次PCR使用IPV-F1 (5'-GCCTCCACATCATTGGCTTCG-3') 和IPV-R1 (5'-TCGGGTGTCATCAACAAACTCATA-3')為引子，擴增出一個754 bp的片段(圖1A)；第二次PCR則以IPV-F2 (5'-ACATCATTGGCTTCGTAT-3') 和IPV-R2 (5'-ACAGAGCAGGAGATTGGA-3') 為引子，擴增出一個395 bp 的片段 (圖1B)。兩者的擴增步驟均依序為：先以94℃反應5分鐘，接著以94℃反應30秒、56℃反應60秒及72℃反應60秒，並將後續三步驟重覆30個循環，最後以 72℃反應10分鐘。接續將核酸產物利用電泳膠體分析，並將膠體置入照膠系統照相確認片段長度。
圖1、巢式RT-PCR引子的靈敏度和重複性分析。M：標記；1-8：不同濃度的IPV陽性標準品（107–100 copies/μl）；9：陰性對照組 (圖片來源： Zhao et al., 2023)
TaqMan qPCR檢測引子 IPVq-F (5'-GAAGATGTCATCGTCCCAGAGTT-3') 和 IPVq-R (5'-GGAATGCCCCCTCCGTAT-3') 與IPVq探針 (5'-CCCCAAGGTTTTATTG-3')，使用108–101 copies/μl不同濃度的IPV陽性標準品為模板進行反應，將1.5 μl cDNA 樣品加入15 μl 反應混合物中，每種引子各含1 μl，然後進行qPCR，步驟如下：95°C反應60秒，然後在95°C反應15秒和60°C反應30秒下進行40個循環。根據已知拷貝數的Cq值 (圖2B為qPCR操作流程中，開始顯著地增加螢光強度時的擴增循環數目) 繪製標準曲線 (圖2A)。此方法靈敏度高、準確、專一及快速穩定，因為是採用非常敏感的化學螢光，而且不需要再繼續處理PCR反應後的電泳膠體分析，可於短時間內即可取得檢驗結果，此外，因為反應後不需打開管子而減少了操作污染。
IPV檢測方法之建立有助於控制與預防疾病的感染，避免影響羅氏沼蝦養殖產量，進而有助於產業的永續發展。
圖2、TaqMan探針即時定量 PCR (qPCR)。A，qPCR 的標準曲線。在一定範圍內連續稀釋 10 倍的 IPV 陽性標準品即時擴增和分析 108–101 copies/μl。根據已知拷貝數的 Cq 值繪製標準曲線，R2 = 0.999；B，IPV 陽性標準品稀釋液的代表性擴增圖 (圖片來源： Zhao et al., 2023)
主要參考資料
Zhao, C., Q. Miu, S. Liu, D. Zhou, X. He, J. Pang, S. Weng and J. He (2023) Detection methods, epidemiological investigation, and host ranges of infectious precocity virus (IPV). Aquaculture, 562 (15): 738818 (https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2022.738818)